In römischer Zeit diente das Gelände außerhalb des Stadttors Porta Vercellina, auf dem die heutige Kirche steht, als Friedhof. Nach dem Edikt von Mailand durch Kaiser Konstantin, das 313 n. Chr. den bis dahin verfolgten Christen u.a. den Bau von eigenen Kirchen erlaubte, waren hier Grabkapellen und Gedenkstätten einiger Märtyrer errichtet worden, unter ihnen Victor, Nabor und Felix.
Direkt nördlich der Kapelle des Victor ließ der Mailänder Bischof Ambrosius zwischen 379 und 386 eine große, dreischiffige Basilika zur Verehrung der Märtyrer Nabor und Felix sowie Gervasius und Protasius erbauen, die Kirche Ss. Nabore e Felice. Von dieser querschifflosen Kirche, die in ihren Maßen in etwa dem heutigen Bauwerk entsprach, haben sich nur wenige Reste erhalten: die vier roten Säulen aus Porphyr, die das Ziborium über dem Altar tragen, einige Säulenbasen und ein Bruchstück der damaligen Dekoration der Apsis.
Nach seinem Tod wurde Ambrosius neben Gervasius und Protasius bestattet. Schon früh erhielt die Kirche daraufhin den Namen Basilika Ambrosiana. Die hohe Bedeutung dieser Kirche wird an dem Umstand deutlich, dass eine Reihe von Bischöfen hier am Grab ihres heiligen Vorgängers die Bischofsweihe empfangen haben.
Im Jahre 784 wurde im unmittelbar angrenzenden Bereich der heutigen Katholischen Universität eine Benediktinerabtei gegründet, die fünf Jahre später von Karl dem Großen ihre Bestätigung erhielt, der sie um eine Gemeinschaft von Kanonikern erweiterte. Die bisherige Kirche war für diese neuen Anforderungen zu klein: die Mönche fügten noch im 8. Jahrhundert am Ostende einen neuen Chorraum mit darunter liegender Krypta an. Im 9. Jahrhundert erhielten auch die Seitenschiffe Apsiden, und das Atrium wurde angelegt. Bischof Angilberto II. stiftete um 846 einen goldenen Altarvorsatz, Werk des Volvinius. Wenig später wurde, angeregt durch das Vorbild von Alt St. Peter in Rom, der rechte Kirchturm erbaut, bis heute Campanile dei Monaci (Turm der Mönche) genannt. Mit seinem quadratischen Grundriss ist er einer der ersten, wenn nicht der erste lombardische Kirchturm überhaupt.
Zwischen 1018 und 1050 wurden die antiken Säulen aus der Kirche entfernt und durch Pfeiler mit vorgelagerten Diensten ersetzt. Dies ermöglichte in der Folge, die Kirchenschiffe mit einem Gewölbe auszustatten, wobei das Gewicht über die Dienste nach unten abgeleitet werden konnte. Etwas später wurden in lombardischen Formen auch das Atrium umgestaltet und der Vierungsturm sowie abschließend der zweite Glockenturm (Campanile dei Canonici, zwischen 1129 und 1144) errichtet. Außerdem wurden einige eingestürzte Joche im Westteil der Kirche verstärkt wieder aufgebaut.
Im 15. Jahrhundert wurde die Victorkapelle mit der Kirche verbunden. Das Ende dieses Jahrhunderts kann als die größte Blütezeit des Klosters angesehen werden. Kardinal Ascanio Sforza hatte 1497 als Kurator des Klosters die Ablösung der Benediktiner durch Zisterzienser aus der in der Nähe von Mailand gelegenen Abtei Chiaravalle angeregt. Aus dieser Zeit stammen die Kanonikergebäude von Bramante im Norden der Kirche.
Im 16. und 17. Jahrhundert wurden einige Seitenkapellen angefügt. Damit waren die wesentlichen Arbeiten abgeschlossen; 1863 war eine umfassende Restaurierung erforderlich. Diese erfolgte ab 1871 unter Erzbischof Luigi Nazari di Calabiana. Nach der französischen Besetzung in der Folge der Revolution wurde das Kloster aufgelöst und diente kurzzeitig als Krankenhaus. Doch unter österreichischer Herrschaft begann eine neue Blüte. Am 23. April 1874 wurde die Kirche zur Basilica minor erhoben. Ein alliierter Bombenangriff im August 1943 hatte schwere Schäden zur Folge, die aber bereits 1951 behoben waren.
Das der Kirche vorgelagerte Atrium war früher der Ort, an dem sich u.a. während des Gottesdienstes die Katechumenen versammelten, da sie noch nicht an der Hl. Messe in der Kirche teilnehmen durften. Die heutige Gestalt des Atriums stammt aus dem Jahr 1150. Die Kapitelle der Säulen zeigen Blumen oder christliche Symbole. Die kämpfenden Tiere versinnbildlichen den Kampf des Guten gegen das Böse.
An den Wänden des Atriums haben sich einige wenige, teilweise aus dem Mittelalter stammende Fresken erhalten. Außerdem stößt man auf zahlreiche Grabplatten. Die der ursprünglichen Kirchenfassade vorgesetzte, mit lombardischen Zierelementen versehene Loggia ist in zwei Bogenreihen gegliedert, deren untere aus drei gleich hohen, die obere hingegen aus fünf symmetrisch zur Dachneigung abfallenden Bögen besteht. Solche Loggien wurden häufig zur Spendung des Segens genutzt.
Vom Atrium hat man einen guten Blick auf die beiden Kirchtürme. Solche Doppelturmfassaden tauchten kurz vorher erstmals an Alt St.Peter in Rom sowie der zweiten Kirche von Cluny in Burgund auf und wurden wegen der großen Bedeutung dieser beiden Orte in der Folge häufig kopiert. Der linke Turm blieb lange Zeit unvollendet; noch heute kann man am Mauerwerk die Ergänzungen aus dem 19.Jh. erkennen.
Im Inneren stößt man auf zwei Säulen, die eine mit einer Schlange, die andere mit einem Kreuz auf der Spitze. Diese waren um das Jahr 1000 vom damaligen Erzbischof Arnolf aus Konstantinopel nach Mailand gebracht worden. Damals angesehen als Abbild der Ehernen Schlange des Mose (vermutlich aber eher ein heidnisches Symbol für Äskulap), steht sie heute als Zeichen des Bösen, das dem Guten unterliegt.
Die nahe gelegene Kanzel gehört zu den bedeutenden Ausstattungsstücken. Sie wurde zwischen 1204 und 1212 über einem frühchristlichen Sarkophag aus dem 4. Jh. errichtet. Dieses Sarkophag des Stilicho genannte Grab ist reich mit Skulpturen geschmückt, die u.a. Abbildungen der Apostel zeigen. Das Lesepult aus Kupfer (11.Jh.) symbolisiert die Evangelisten Mathäus (Mensch) und Johannes (Adler).
Der berühmte paliotto, mit der weltweit einzigen erhalten gebliebenen karolingischen Altarverkleidung, entstanden zwischen 824 und 856, zeigt an der goldenen Vorderseite (Antependium) Christus mit den Aposteln, an den silbernen Seiten Erzählungen aus den Evangelien und an der Rückseite Episoden aus dem Leben des Ambrosius.
Hinter dem Ziborium (12.Jh.) mit dem darunter stehenden Altar erstreckt sich der Chorraum, der eigentliche Gebetsraum der Mönche. Das hölzerne Chorgestühl stammt aus dem 15. Jh., der steinerne Bischofsthron aus dem 9.Jh. Darüber erhebt sich das Apsismosaik aus dem 12.Jh., das jedoch in den folgenden Jahrhunderten vielfach restauriert wurde. Es stellt in der Mitte den herrschenden Christus dar, flankiert von den beiden Märtyrern Gervasius und Protasius sowie den Erzengeln Michael und Gabriel.
Südlich des Chorraums befindet sich der Zugang zur Victorkapelle. Diese frühchristliche Grabkapelle ist reich mit Mosaiken aus der Erbauungszeit ausgestattet, von denen eines Ambrosius mit individuellen Zügen darstellt - eine seltene, für weitgehend authentisch gehaltene Abbildung.
In der Kirche finden sich die sterblichen Überreste zahlreicher Heiliger: Neben den bereits erwähnten Ambrosius, Gervasius, Protasius und Victor auch Marcellina, die Schwester des Ambrosius. Außerdem ist Kaiser Ludwig II. in der Kirche bestattet.
Die Orgel wurde 1951 von der Orgelbaufirma Balbiani-Vegezzi Bossi (Mailand) erbaut. Das Instrument hat ist auf drei Gehäuse im Kirchenraum verteilt. Es hat 38 Register auf drei Manualwerken und Pedal. Die Spiel- und Registertrakturen sind mechanisch.
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