Die Herzogsgruft befindet sich unter dem Mittelchor des Wiener Stephansdomes und wurde um 1363 von Herzog Rudolf IV. in Auftrag gegeben.
Sie war die erste derartige Anlage der später so genannten Katakomben von St. Stephan und diente den Habsburgern bis über die Mitte des 16. Jahrhunderts hinaus als wichtigste Familiengrablege. Weiters wurden in ihr ab 1654 bis 1878 die Eingeweide-Urnen von rund 75 verstorbenen Habsburgern beigesetzt.
Ursprünglich bestand die Gruft aus einem rechteckigen gewölbten Raum unter dem Mittelchor und in der Längsachse des Doms ausgerichtet (der jetzt als Urnenraum genutzt wird). Der Zugang erfolgte über einen 24-stufigen Abgang, der von zwei Gruftplatten abgedeckt wurde. Nach der Beisetzung Erzherzog Karls (1565–1566), Sohn von Kaiser Maximilian II., geriet die Gruft in Vergessenheit. Als der kaiserliche Kammerdiener Schnepf unweit der Herzogsgruft sich eine Familiengruft errichten ließ, wurde diese 1645 wiederentdeckt und Kaiser Ferdinand III. verfügte, dass zukünftig in der Gruft die Eingeweide-Urnen der Habsburger beigesetzt werden sollen. Die erste Beisetzung fand dann 1654 statt und mit der Eingeweide-Urne von Erzherzog Franz Karl 1878 die letzte, weil ab da durch verbesserten Konservierungsmethoden die Eingeweide mit dem Leichnam einbalsamiert wurden.
1754/1755 ließ Maria Theresia die Herzogsgruft um einen ovalen Raum Richtung Osten erweitern und die Gebeine ihrer Vorfahren, deren alte Särge man 1739 geöffnet hatte und von Marquard Herrgott dokumentiert wurde, in neue Särge umbetten. 1956 erfolgte eine Renovierung und Umgestaltung der Herzogsgruft, dabei wurden die Särge im ovalen Raum neu positioniert und in der ursprünglichen Gruft Nischen eingebaut, in denen man hinter Gittern die rund 75 Eingeweide-Urnen aufstellte. 1967 erfolgte eine neuerliche Umgestaltung der Gruft.